Seit seiner Zeit als Nachtwächter sind einige Jahre vergangen und Larry Daley (Ben Stiller) hat es zu geschäftlichem Erfolg als Erfinder gebracht, der seine Artikel im Werbefernsehen erfolgreich anbietet. Seine Freunde im Museum, die nachts dank der geheimnisvollen Tafel zum Leben erweckt werden, hat er nur noch selten besucht, so dass er von der Nachricht überrascht wird, dass sie ausgelagert werden sollen, um das Museum zu modernisieren. Nach einem wehmütigen Abschied und im Glauben, dass sie nie wieder nachts lebendig werden, da die Tafel im alten Museum verbleiben soll, erhält er einen plötzlichen Anruf von Jedediah (Owen Wilson), dem winzigen Cowboy. Der kleine Kapuzineraffe hatte einfach die Tafel geklaut, weshalb nicht nur die Larry Daley vertrauten Figuren nachts zum Leben erweckt werden, sondern eine Vielzahl von üblen Burschen, die böses im Sinn haben…
